La secuenciación de RNA unicelular avanza hacia nuevas aplicaciones

Como tecnología de secuenciación emergente, la secuenciación de RNA de una sola célula (single-cell RNA sequencing, scRNA-Seq) se ha convertido en una herramienta poderosa para determinar la heterogeneidad celular al abordar la clasificación de subpoblaciones celulares y analizar eventos moleculares clave en diversas enfermedades, logrando un análisis multidimensional de alto rendimiento de células individuales.

La secuenciación tradicional del RNA (bulk RNA-Seq), en cambio, promedia la expresión génica de múltiples células, lo que oculta la heterogeneidad celular. Al analizar células individuales, la scRNA-Seq permite mejorar la precisión en el estudio de la expresión génica.

Una revisión publicada en el International Journal of Molecular Science analiza la evolución de la scRNA-Seq, destacando los últimos avances de esta tecnología en investigaciones de vanguardia en embriología, histología, oncología e inmunología. Los autores anaizan también los problemas clave que actualmente aborda la scRNA-Seq y su gran potencial para explorar dianas diagnósticas de enfermedades y descubrir dianas terapéuticas farmacológicas en combinación con tecnologías multiómicas.

¿Cuáles son los pasos claves de la tecnología de scRNA-Seq?

En primer lugar, se aislan las células individuales empleando técnicas como dilución en serie, micromanipulación, clasificación celular activada por fluorescencia (una variante avanzada de la citometría de flujo que utiliza etiquetas fluorescentes para ordenar y analizar células) y microfluidos.

Los métodos más antiguos, como Smart-Seq2, basados en placas, ordenan las células en pozos individuales, procesando el RNA de cada pozo por separado y la transcripción inversa se realiza individualmente por pozo, manteniendo los transcritos separados. Son métodos que permiten procesar cientos a miles de células en forma individual, lo que es costoso y requiere mucho tiempo y trabajo manual.

Los métodos de gotas como 10x Genomics, más recientes, utilizan dispositivos microfluídicos. Cada célula individual es encapsulada dentro de una gota de aceite con enzimas y una perla que contiene un oligo-dT y un código de barras molecular único en su superficie (UMI / unique molecular identifier). Esta etapa es fundamental, por lo que los nuevos dispositivos tratan de aumentar el número de gotas que contengan una célula y una perla. Dentro de la gota, la célula se lisa y su RNA, atrapado por la perla, se transcribe inversamente a cDNA, etiquetado con el código de barras. Según la plataforma, la transcripción inversa a cDNA se realiza luego de extraer las perlas o en la misma gota. Este método permite procesar decenas de miles de células en un par de tubos.

A continuación se realiza la construcción de bibliotecas de cDNA. Actualmente, se utilizan la amplificación por PCR, la amplificación por transcripción in vitro (IVT) y la replicación de la polimerasa Phi29, siendo la amplificación por PCR el método predominante.

A través del procesamiento bioinformático se analizan los datos, con normalización, eliminación de ruidos, reducción de dimensionalidad y análisis de expresión diferencial.

La scRNA-Seq se está utilizando para mapear perfiles transcripcionales en el desarrollo embrionario, clasificando células en diferentes etapas y revelando genes clave en diferenciación. En la investigación en cáncer, la scRNA-Seq ha revelado la heterogeneidad tumoral y permite identificar subpoblaciones celulares en diversos tipos de cáncer y analizar las interacciones entre células inmunitarias y células cancerosas en el microambiente tumoral. Ese análisis permite investigar mecanismos de resistencia a fármacos y detectar nuevas dianas terapéuticas.

Otra aplicación clave de la scRNA-Seq es en el estudio de la diferenciación de células inmunitarias y la heterogeneidad de la respuesta inmune. En enfermedades autoinmunes como lupus y esclerosis sistémica se han identificado subpoblaciones celulares relevantes.

Según la publicación, también se está usando para estudiar el mecanismo de acción de tratamientos herbales en osteoporosis, fibrosis hepática y diabetes en la medicina tradicional china.

Sin embargo, esta técnica presenta aún varias limitaciones que afectan su precisión y aplicabilidad, como la captura de todos los transcriptos presentes en una célula o la heterogeneidad celular por stress o diferentes fases del ciclo celular, afectando los perfiles de expresión.

La scRNA-Seq ha revolucionado la investigación biomédica, permitiendo estudios más detallados de la heterogeneidad celular. Los futuros enfoques tecnológicos apuntan a mejorar la eficiencia de captura de células, el tiempo insumido por el ciclo, la reproducibilidad y el costo, y así seguir ampliando su aplicabilidad en medicina personalizada, inmunoterapia y farmacología.