Secuenciación dirigida por CRISPR-Cas9 y Nanopore permite rastrear la resistencia antimicrobiana

La resistencia a los antimicrobianos (Antimicrobial Resistance, AMR) es una amenaza global que afecta con mayor fuerza a los países de ingresos bajos, donde el uso indiscriminado de antibióticos en personas y animales acelera la diseminación de genes de resistencia (Antimicrobial Resistance Genes, ARG). Conocer cómo y en qué medida esos genes se transfieren entre reservorios humanos, animales y ambientales es esencial para diseñar intervenciones One Health. Sin embargo, los métodos tradicionales presentan limitaciones, ya que la secuenciación metagenómica requiere una gran profundidad para detectar ARG poco abundantes y el cultivo más WGS (Whole Genome Sequencing) pierde los datos de las bacterias no cultivables.

En un trabajo publicado en Nature Communications (2025), los autores desarrollaron Context-Seq, un flujo de trabajo que combina corte selectivo por Cas9 guiado por RNA y secuenciación de lecturas largas en Oxford Nanopore. Tras desfosforilar el DNA total, Cas9 genera extremos fosforilados únicamente en los sitios diana; solo esos fragmentos aceptan adaptadores y entran al poro.

Se seleccionaron blaCTX-M, una β-lactamasa de espectro extendido ((Extended-Spectrum Beta-Lactamases, ESBL) de alta relevancia clínica, y blaTEM, familia distribuida globalmente, con alelos que van de resistencia a penicilina a ESBL, después de cribar 14 ARG en muestras fecales de humanos, caninos y aves de corral de Nairobi, todas positivas para tetA, sul1 y blaTEM.

Se procesaron 13 muestras fecales procedentes de cuatro hogares (adultos, niños, perros y pollos). Cada muestra se secuenció en un flow-cell MinION individual. En promedio, 0,4 % de las lecturas contenían blaTEM/CTX-M, pero su cobertura media superó con holgura la obtenida sin enriquecimiento.

La técnica permitió realizar lecturas largas con contexto génico. Los fragmentos portadores de blaCTX-M oscilaron entre 1,7 kb y 17,4 kb e incluían transposasas, genes de replicación y fagos. Los de blaTEM llegaron a 23 kb, con módulos de transferencia y múltiples ARG co-localizados, como sul2, aph, mphA y qnrS1.

También se identificaron hospedadores y vehículos. Los ARG se asignaron sobre todo a Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus influenzae, tanto en plásmidos como en cromosomas.

Se demostró la transmisión entre especies y hogares. Se hallaron 23 clústeres compartidos; de ellos, 11 involucraban humanos y animales, 11 solo animales y 1 solo humanos. Más de la mitad aparecieron en distintos barrios, a varios kilómetros, sugiriendo circulación comunitaria.

Cuando se realizó la comparación con cultivo más Illumina, Context-Seq recuperó todos los ARG que el estudio paralelo halló en E. coli y, además, detectó blaCTX-M/TEM en dos muestras donde el cultivo falló, ilustrando su capacidad para revelar reservorios no cultivables.

Desde el punto de vista de su implicancia en la visión One Health, la técnica mostró que perros y aves de corral compartían 7 de los 11 clústeres animal-animal, evidenciando presiones selectivas similares o ingestión cruzada de heces. La presencia de blaCTX-M-15 en K. pneumoniae y de blaTEM en H. influenzae amplía la lista de patógenos prioritarios capaces de vehiculizar AMR en entornos urbanos densos. La técnica puede aplicarse a intervenciones focales, como higiene en corrales o campañas veterinarias, al mostrar qué especie y qué elemento móvil conectan los reservorios.

Con respecto a las limitaciones, los autores señalan que la secuenciación Nanopore R9.4.1 mantiene un error base del 5-10 %. Alelos muy similares o próximos podrían colapsar en el consenso. Además, la taxonomía de plásmidos en Enterobacteriaceae sigue siendo compleja, una taxonomía imprecisa podría dificultar su identificación y seguimiento. Además, el estudio no incluyó suelo ni agua, reservorios claves para completar la cadena ecológica. La necesidad de 1,5-3 µg de DNA limitaría matrices de baja biomasa.

Context-Seq demuestra que el enriquecimiento Cas9 más lecturas largas es una estrategia robusta, rápida, de 1 a 2 días, y relativamente económica para mapear ARG y su entorno genético directamente en DNA total. El método multiplica la cobertura de genes clínicamente críticos sin secuenciar gigabytes irrelevantes, identifica huéspedes patógenos y elementos móviles, y revela rutas de transmisión invisibles al cultivo.